RNAi เป็นกระบวนการที่เกิดขึ้นโดยปกติตามธรรมชาติของเซลล์ยูคาริโอต ทั่วไป ซึ่งกระบวนการเหล่านี้มีความสำคัญมากต่อการดำรงอยู่ของสิ่งมีชีวิต โดยเฉพาะสิ่งมีชีวิตชั้นต่ำ หน้าที่สำคัญของกระบวนการนี้อาจกล่าวโดยสรุปได้เป็น 3 ก้น คือ การป้องกันและต่อต้านการติดเชื้อไวรัส การป้องกันจีโนม (genome) จาก ยีนสัญจร (jumping genes)หรือทรานสโพซอน และ การควบคุมการแสดงออกของยีน

RNAi มีความสำคัญในกระบวนการป้องกันและต่อต้านการติดเชื้อไวรัส โดยเฉพาะอย่างยิ่งในสิ่งมีชีวิตชั้นต่ำ ไวรัสหลายชนิดมีสารพันธุกรรมเป็นแบบ dsRNA ซึ่งเมื่อไวรัสเหล่านี้ปลดปล่อยสารพันธุกรรมเข้าสู่เซลล์ dsRNA จะถูกตัดเป็น short interference RNA (siRNA) โดย Dicer ซึ่งเป็นเอ็นไซม์ที่มีอยู่แล้วในสิ่งมีชีวิตบางชนิด จากนั้น Dicer จะกระตุ้นให้ RISC complex เข้ามาจับ และตัดสาย RNA เกิดการยับยั้งการสร้างโปรตีน ทำให้ไวรัสไม่สามารถก่อโรคได้

RNAi ยังมีความสำคัญในการป้องกันจีโนม (genome) จาก ยีนสัญจร(transposons) ซึ่งเป็นลำดับของดีเอ็นเอ ที่สามารถเคลื่อนที่ไปได้ทั่วจีโนมของสิ่งมีชีวิต และพบยีนสัญจรได้ในสิ่งมีชีวิตทุกชนิด ซึ่งในกรณีที่ยีนสัญจรเคลื่อนไปอยู่ในตำแหน่งที่ไม่ถูกต้องและมีความสำคัญจะทำให้เกิดความเสียหายแก่เซลล์ของสิ่งมีชีวิตได้ ยีนสัญจรหลายๆชนิดทำงานโดยการถอดรหัส ดีเอ็นเอ ให้เป็น RNA ก่อน และจากนั้นจะถอดรหัสกลับเป็นดีเอ็นเอแล้วไปแทรกอยู่ในตำแหน่งอื่นๆของจีโนมต่อไป บ่อยครั้งที่ RNA ที่เกิดขึ้นจะเป็น dsRNA และเป็นตัวเริ่มต้นกระบวนการ RNAi ดังนั้น RNAi จึงมีบทบาทช่วยป้องกันจีโนมจากยีนสัญจรโดยการทำลาย dsRNA

นอกจากนั้น RNAi ยังเป็นกลไกสำคัญที่มีบทบาทในการควบคุมการแสดงออกของยีน ที่พบในสัตว์หลายชนิด ตั้งแต่ระดับกลุ่มหนอนพยาธิจนถึงระดับสัตว์เลี้ยงลูกด้วยน้ำนม พบว่ายีนหลายร้อยตำแหน่งในจีโนมของมนุษย์จะได้รับการถอดรหัสออกมาเป็น RNA ขนาดเล็กที่เรียกว่า microRNA (miRNA) ซึ่ง miRNA จะบรรจุชิ้นส่วนของลำดับของยีนต่างๆ ดังนั้น miRNA เหล่านี้จึงอาจเกิดเป็นโครงสร้างสายคู่ได้ เช่น เกิดเป็น hairpin RNA (hpRNA) เมื่อเกิดเป็น hpRNA ที่เป็น dsRNA ขึ้นจะเป็นการกระตุ้นให้เริ่มกระบวนการ RNAi ทำให้เกิดการยับยั้งการแสดงออกของยีน

ปัจจุบันเป็นที่ทราบกันว่า miRNA มีบทบาทสำคัญต่อการพัฒนาของสิ่งมีชีวิตและการควบคุมการทำงานของเซลล์ โดยมีส่วนร่วมในกระบวนการพื้นฐานทางชีววิทยาต่างๆ ไม่ว่าจะเป็นการเปลี่ยนแปลงไปทำหน้าที่เฉพาะของเซลล์ (cell differentiation) การตายตามโปรแกรมเฉพาะของเซลล์ (apoptosis) เป็นต้น